La “Sinfonía en re mayor" WoO.99 fue compuesta entre el 15 de julio y el 1 de septiembre de 1835 en Roma, con el fin de presentarla a un concurso de composición organizado en Viena, para promocionar la escritura de nuevas sinfonías. Mientras redactaba su obra, el compositor francés Ambroise Thomas, que había conseguido el Prix de Rome, le había regalado las cuatro primeras sinfonías de Beethoven en partitura orquestal. Su estudio influiría en su propia obra sinfónica.
Nicolai no gana el premio de Viena, que sería concedido a Franz Lachner por su “Sinfonia passionata”, aunque logra la tercera plaza. Después de haber guardado su sinfonía durante años, en el mes de septiembre de 1845 la revisó profundamente. La obra se estrenó el 30 de noviembre de 1845 en la Groβen Redoutensaal de Viena, dentro de un programa dedicado enteramente a sus obras.
El primer movimiento, andante, allegro, se ve influenciado claramente por la técnica compositiva de Beethoven. Después de la introducción lenta, el tema principal fuertemente dominado por acordes, es presentado por violoncelos y contrabajos sobre un acompañamiento suave de la cuerda aguda. Un segundo tema más suave aparece a continuación. El desarrollo es amplio, siguiendo las normas clásicas y empleando formas contrapuntísticas. Un retorno al principio lento prepara la reexposición y más tarde la coda.
El segundo movimiento, adagio, presenta un tema principal de suave melodismo. Un nuevo motivo de carácter rítmico sirve de contraste. Continuamos moviéndonos dentro de la atmósfera de Beethoven, comparándolo con el adagio de su novena.
El tercer movimiento, scherzo, tiene la particularidad de repetir el trio de carácter contrastante y finalizar con un solo de timbal que recuerda nuevamente a Beethoven.
El cuarto movimiento, finale, allegro vivace, que posee un tema principal heroico, en forma de marcha, alternando con motivos melódicos en construcciones contrapuntísticas. Antes de la coda se recuerdan temas de los movimientos anteriores, al modo de Beethoven en su novena, para dar una unidad estructural a la obra. Finaliza brillantemente con el tema principal.
En Italia se siente atraído por el Teatro lírico, empezando una carrera en 1838 como compositor operístico. Cuando regresa a Viena triunfa con su ópera “Il Templario”, siendo conocido como il Maestro Ottone Nicolai. Consigue el cargo de Kapellmeister de la Wiener Hofoper, Opera de la Corte de Viena, en 1841. Al año siguiente fundó los conciertos de la Filarmónica. Con ella dirige en Viena las sinfonías de Beethoven.